Poco a poco los patrones medievales del Gótico se van abandonando, las nuevas doctrinas y formas artísticas que provienen de Flandes y de la Península Ibérica, dan paso a nuevas tendencias. El siglo XVI es considerado como una de las etapas más brillantes del arte aragonés. En Aragón se intensifica el trabajo  de la escultura que se enriquece con la utilización de materiales de gran calidad como el alabastro. Entre las colecciones del Museo destacan las producciones de Damián Forment; muestra patente de su forma de trabajar es la obra en alabastro policromado de San Onofre, (hacia 1520), de estudio minucioso del detalle y gran fuerza expresiva.

En la década de los años 1530, la asimilación del lenguaje artístico italiano en pintura, vendrá sobre todo de la mano del zaragozano, Jerónimo Vallejo Cosida, cuyo estilo se caracteriza por la delicadeza de los detalles, belleza y dulzura. Otros artistas como Juan de Juanes conocen la pintura italiana por medio de la influencia directa de otros maestros, como demuestra su Retrato de Alfonso V o  La Adoración de los Reyes magos de Pablo Scheppers,  que junto con Rolán de Mois, reflejan en sus obras las nuevas tendencias flamencas.

Una extraordinaria y destacable obra, es el Doble Retrato de matrimonio, realizado por Lavinia Fontana, una pequeña pintura sobre cobre realizada hacia 1577-1585, que muestra el gusto por el detalle, las calidades y el cromatismo.